Western blot
Western blot, WB eller Western blotting, eller immunoblot, er en vanlig molekylærbiologisk metode som benyttes innen proteinkjemien for å detektere og identifisere spesifikke proteiner med hjelp av antistoffer. Western blot benyttes i prinsippet ved alle laboratorier som bedriver biomedisinsk og biomolekylær forskning, men også ved klinisk medisinsk diagnostikk i visse sammenhenger.
Uttrykket Western blot rediger
Uttrykket er dannet i analogi med Southern blot, som er en lignende metode for å detektere DNA. Den metoden ble oppkalt etter sin opphavsmann, den engelske biologen Edwin Southern. På lignende måte foretar man deteksjon av RNA med en metode som kalles Northern blot.[1] Det var W. Neal Burnette som i 1981 begynte å bruke uttrykket «western blot»,[2] men selve metoden oppstod i 1979 i Harry Towbins laboratorium ved Friedrich Miescher Institute i Basel i Sveits.[3]
Fremgangsmåte rediger
Det første steget ved en WB-analyse er å frembringe proteininnholdet fra de celler eller vev som skal studeres. For å kunne separere proteinene fra cellenes andre bestanddeler må man første behandle celler og vev slik at de kan analyseres. Vevprøver kan nedbrytes i en homogenisator eller med ultrasonikering. Celler kan behandles på samme måte som vev, eller lyseres. Lysering av celler skjer ved at cellemembranen løses opp med en detergent. Lysatet man har utvunnet sentrifugeres for å separere proteinene fra lipider, cellekjerner og andre cellestrukturer.
Proteinene i lysatet separeres deretter med SDS-PAGE, en metode som separerer proteiner med hensyn til molekylmasse (eller molekylærvekt) som for proteiner måles i Dalton (angis oftest med prefikset kilo, kDa). SDS binder og denaturerer proteiner, og gjør dem negativt ladet. Proteinene får vandre i et elektrisk felt ved en polyakrylamidgel, der de separeres.
Neste steg, kalt blotting, er å overføre proteinene til en nitrocellulose- eller polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) med hjelp av en elektrisk spenning. Når proteinene er blitt overført, blokkes membranen for å forhindre uspesifikk binding av antistoffene til membranens overflate. Vanlige blokkløsninger lages av bovint serumalbumin (BSA) eller fettfri tørrmelk.
Etter blokkingen appliseres et spesifikt antistoff (primært antistoff) på membranen, hvis spesifisitet gjør at det binder til det proteinet som er av interesse. Deretter appliseres et sekundært antistoff som binder til det primære antistoffet. Det sekundære antistoffet er lenket til et enzym hvis katalytiske egenskap omdanner et substrat til et reaksjonsprodukt som kan detekteres, enten ved at man ser et fargeomslag på membranen, eller indirekte ved at man sender ut kjemiluminescent lys som kan fanges på lyssensitiv film, sees med CCD-kamera eller med en type phosphorimager.
Referanser rediger
- ^ «Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes». Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 74 (12): 5350–5354. 1977. Bibcode:1977PNAS...74.5350A. PMC 431715
. PMID 414220. doi:10.1073/pnas.74.12.5350.
- ^ Burnette WN. (1981). «'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A». Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. PMID 6266278. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5.
- ^ «Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications». Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9): 4350–54. 1979. Bibcode:1979PNAS...76.4350T. PMC 411572 . PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350.
Eksterne lenker rediger
- (en) Western blot – kategori av bilder, video eller lyd på Commons
- Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012). «Western blot: Technique, theory, and trouble shooting». North American Journal of Medical Sciences. 4 (9): 429. PMC 3456489 . PMID 23050259. doi:10.4103/1947-2714.100998.
- «Western Blotting». YouTube. Bio-Rad Laboratories. 16. oktober 2012.
- «Blotting Techniques/ The Principle of Western Blotting». YouTube. Biomedical and Biological Sciences. 23. mars 2017.
- Western blotting for Newbies Arkivert 15. mai 2021 hos Wayback Machine.
